课程37
生物药品质量分析概况与发展趋势

生物药品，就是把生物工程技术应用到药物制造领域，从而获得生物医药制品。是以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织为起始材料，采用生物学工艺或分离纯化技术、制备并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活化制剂，包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、血清、血液制品、免疫制剂、细胞因子、抗原、单克隆抗体及基因工程产品等。目前，生物制药产品主要包括三大类：基因工程药物、生物疫苗和生物诊断试剂。其在诊断、预防、控制乃至消灭传染病中发挥着越来越重要的作用。生物技术引人医药产业，使得生物医药业成为最活跃、进展最快的产业之一。
药品是人们用于防病治病，康复保健的特殊物质。药品的质量好坏直接影响人们的健康和生命。因此药品质量监督检验对保障人们用药安全有效、合理，维护人们的身体健康有着及其重要的意义。生物药品不同于一般的药品。一般药品是用重现性较好的物理和化学技术进行生产和质量控制的。而生物药品的原辅材料需要种类多质量要求高，生产涉及生物学技术，其生产检验的可重复性远远低于物理化学的方法。建立规范的质量控制标准是保证生物药品质量的重要途径，本文就疫苗、血液制品等生物药品的质控现状做一简述。
        1. 生物药品的特点
生物药品生产涉及到生物学过程和生物材料，如细胞培养或从活的生物体中提取，这些生物过程有其固有易变性。此外，用于这些培养过程的物料又是微生物繁殖的良好基质，例如生物制品中的血液制品生产，从血浆中分离血浆蛋白，粘度大，不易清洗、消毒，又是细菌很好的营养液。所以，生物药品系生产须无菌而又不能在最后的容器中灭菌的无菌制剂。总结起来生物药品具有以下特点：
（1）原材料都是活性材料，故对其储存、加工等有要求；
（2） 生产加工工艺过程是生物学过程；
（3）检验和控制质量采取生物学方法(有变异性）；
（4）生产过程中保持无菌，最后也不能灭菌，所以全过程需要执行GMP。
        2. 各类生物药品的质控现状、问题及解决方法
2.1疫苗
2.1.1疫苗的质控现状
疫苗是将病原微生物（如细菌、病毒、立克次氏体等）及其代谢产物，经过人工减毒、培养、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的生物药品。疫苗的预防接种不但保护个体免受传染病病原体的侵袭，而且在群体中限制了病原微生物的传播。疫苗的发明与使用，是人类文明的伟大成就。
相比成分单一的化学药品而言，疫苗一般为成分复杂的多组分制品，我国生物药品国家标准中对疫苗质量标准的要求不仅包括成品检验项目和指标的规定，还包括对原辅材料和生产全过程的质量控制。2010年《中国药典》对疫苗质控的主要内容在于：（1）安全性检测项目：包括无菌检查、热原检查、毒性试验、异常毒性试验、残留试剂等。（2）有效性检查，包括：病毒滴度、效价、抗原含量测定等；（3）杂质检查，包括：卵清蛋白、vero细胞残余DNA、细胞基质残留蛋白质、白喉原液抗原纯度等，除此之外，对于其辅料如铝佐剂，防腐剂硫柳汞、苯酚等，都应进行相应的检查。
由新型病毒或细菌引起的突发疾病应运而生的新型疫苗，应第一时间建立起疫苗质控标准和评价方法研究，建立疫苗标准品，规范质控标准和评价方法。毛群颖[1]等根据创新型疫苗研发的要求，充分发挥技术优势，开展EV71疫苗质控标准、标准品和评价方法研究。建立了EV71灭活疫苗的中和抗体和抗原定量测定标准品，统一不同企业疫苗的质控标准，规范疫苗的评价体系，为EV71疫苗的研发提供保障。
2.1.2存在的问题及解决方法
相比国外对疫苗的技术监管，我国在1951年才产生第一部生物药品技术法规，两者之间相差了50年。在我国政府和疫苗制造行业的共同努力下，尤其是经过近20年的快速发展，我国疫苗质量标准与国外的差距已大大缩小，但仍在很多方面存在差距，如杂质的检查和辅料检查等，这就要求我们必须做到：（1）完善疫苗质量标准的思考；（2）进一步加强对生产起始材料的控制，完善生产工艺。进一步加强对生产用菌毒种、生产用细胞的管理和控制，从源头上保证疫苗质量的安全、有效和稳定，开展毒种基因稳定性研究，以及生产用细胞鉴别试验的研究。进一步加强动物来源的原、辅材料的质量控制，开展冻干疫苗中明胶赋形剂的替代研究，提升疫苗的安全性；（3）完善检测方法。提高检测方法的准确性和可靠性，完善标准物质的建立；完善相关检测方法的适用性再验证工作；积极开展新方法研究，特别是涉及疫苗安全性指标的检测以及效价测定方法的研究和应用，进 一步提高检测方法的灵敏度和准确性。
近些年来，国内涌现出了许多控制疫苗质量的新技术和新方法，马庆华等[2]针对b型流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗生产工艺中经常使用的四种化学物质(CNBr、CDAP、EDAC和ADH)进行了检测方法的研究和开发。应用包括液相、液质联用、离子色谱等仪器设备，开发出上述四种物质的检测方法，再运用方法学手段进行了有效的验证，不仅可以用来有效监测多糖蛋白结合疫苗生产过程中残余物质的水平，还可以为企业所进行的生产工艺的验证提供可靠的数据保障。
2.2血液制品
2.2.1血液制品质控现状
血液制品是在临床输血的基础上发展起来，它通过将血浆中的有效组分分离出来并用于治疗。血液制品是重要的生物药品，在医疗急救及某些特定疾病的预防和治疗上血液制品有着其他药品和生物药品不可替代的临床疗效，目前血液制品包括各种人血浆蛋白制品，包括人血白蛋白、免疫丙种球蛋白、凝血因子类、特殊因子类等。对血液制品的控制主要在于以下几方面：（1）血浆复检测：主要包括体检、传染性指标检测；（2）血浆检疫期管理；（3）原辅料检测；（4）生产条件和环境监测；（5）生产工艺控制：乙醇、层析等纯化；（6）病毒灭活工艺考察等。
2.2.2 存在的问题及解决办法
血液质量缺陷主要表现为:脂肪血、凝块血、溶血、纤维蛋白析出等[3]。其成因与许多环节的不规范操作有关，如血液采集与成分制备环节；血液储存、发放与运输环节；血液制品临床使用环节等。因此，对于血液样品的控制主要集中在提高血液采集质量，细化成分制备流程、建立并完善一整套用于血液制品储存和运输的冷链系统、加强医疗机构用血管理，重视输血科规范化建设，确保临床用血安全等方面。
2.3单克隆抗体
2.3.1单克隆抗体的质控现状
1975 年德国科学家 Kohler 和英国科学家 Mil－stein 利用杂交瘤技术将产生抗体的B淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术，单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，其在基因和蛋白质的结构与功能研究方面有着不可或缺的作用，在人类和动植物的免疫学诊断方面至今仍有着无可代替的重要作用[4]。由于单克隆抗体可能含有用传统生产方法不存在的有害物质，所以这类产品的质量控制与传统方法生产的产品有本质的差别，其质量控制更具复杂性和多样性，除需要鉴定最终产品外，还需对培养、纯化等每个生产环节严格控制，才能保证最终产品的有效性、安全性和一致性。
目前单克隆抗体的质控主要包括以下几个方面：（1）检查抗体分泌稳定性：连续克隆化后抗体阳性率达100%，经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，细胞系能保持稳定分泌特异性抗体；（1）观察细胞核学特征：检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特征；（3）鼠源病毒检查，支原体检查及无菌实验；（4）单克隆抗体检定；（5）免疫球蛋白类及亚型测定：用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定；（6）单克隆抗体亲和力测定：用可靠、准确的方法测定单克隆抗体（以下简称为单抗）的亲和常数或相对亲和力。一般情况下，对于免疫原为可溶性的单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原的单抗，测其相对亲和力。（7）特异性检查：测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析。交叉反应：免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的各种正常脏器组织测定。来源于瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤组织的交叉反应试验；（8）效价测定。（9）热原检查；（10）异常毒性试验  （11）外观及PH值；（12）蛋白质含量测定：用Lowry法或其它适宜的方法测定。（13）纯度测定：用电泳法、HPLC法、多聚体测定法等进行测定；（14）DNA含量测定；（15）水分检查（16）杂质检查：单克隆抗体生产过程中产生的杂质包括宿主细胞中的DNA、蛋白、及其纯化过程使用的亲和色谱蛋白 A ( ProteinA) 的浸出液。通过生产过程中的控制，应将这些杂质减小到规定限度之下，因为残余杂质可能影响产品的生物学活性和药理作用，还可能具有毒性。因此，单克隆抗体药物中相关的杂质检查是单克隆抗体类药物质控工作的关键。杂质检查主要包括：外源性 DNA 检查、宿主细胞蛋白( HCP) 检查、蛋白A检查。
2.3.2质量控制中分析方法应用
随着生产工艺及分析手段的进步，单克隆抗体类药物质量控制将更加严格。在下游纯化过程到产品鉴定过程、及批检验过程都需确证其纯度及完整性，并且没有不需要的修饰发生。
2.3.2.1基于电荷大小不同而分离抗体的电泳技术
治疗用蛋白类药物的分析在传统意义上的平板 IEF 的基础上有了较大的发展。毛细管等电聚焦电泳( CIEF) 作为一种特殊的微分离技术，在蛋白质、抗体、临床样品等生命活性物质的分离分析方面已得到越来越广泛的应用。与平板凝胶电泳相比，其具有耗时短、样品用量少、易于自动优化等特点，但其分离过程中的活化步骤容易造成已制定的 pH 梯度变化，造成谱带增宽。而毛细管等电聚焦成像电泳( iCIEF) 则省去了这一步骤，提高了分辨率，重现性好，减少了分析时间，使得样品处理量增加到 2 倍以上[5]
2.3.2.2基于分子质量大小不同而分离抗体的电泳技术
使用毛细管电泳( CE) 则可缩短样品分析时间，并提供相同的纯度和分子大小信息。最近几年，以 CE 为核心技术、以芯片为操作平台的芯片 CE 技术迅速崛起，并成为芯片实验室( Lab-On-Chip) 的主流技术。但是，这项技术对于杂质的检测限为 0.5% ～1.0%，比平板凝胶低 5 倍左右。因此，平板凝胶仍不失为一种较好的纯化方式。
2.3.2.3高效液相色谱( HPLC) 技术
HPLC应用于抗体鉴定、纯化及完整性分析现有很多 HPLC 技术用于单克隆抗体测定，例如离子交换 HPLC、反相 HPLC( RP-HPLC) 和分子排阻色谱，已用于单克隆抗体质量检定的不同方面。如：单克隆抗体亚型检查、肽图检查、多聚体检测等。
2.3.2.4流式细胞术
流式细胞术 (FCM) 是20世纪70年代发展起来的高科技方法，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学和细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。流式细胞术是一种快速、准确、客观，能够同时检测单个细胞的多项特性并加以定量的技术，已广泛应用于生物学、免疫学、药物学、肿瘤学、血液学、临床检验等方面。流式细胞术的最显著特点是可在单个细胞水平对大量细胞进行多参数检测，从而成为T细胞表型分析及功能评价的最佳技术。孙可芳[6]等采用多参数的流式细胞分析技术，对单色、多色荧光标记抗体的偶联率及偶联效果进行分析与评价，并进行稳定性试验。用纯化的小鼠抗人19与荧光染料FIT C(异硫氰酸荧光素 ) 或PE(藻红蛋白)进行标记，通过适当配伍，制备出单色或双色标记抗体。为使其标记的荧光抗体质量稳定可靠，对标记的单色及多色荧光抗体在荧光强度、标记效率 以及稳定性等方面进行了检测，并与国外同类产品进行比较，建立了一套完善的质量控制体系。
2.4动物源性免疫血清制品
2.4.1动物源性免疫血清制品的质控现状
动物源性免疫血清是用特异性抗原（如毒素、类毒素、菌体或病毒等）对动物进行超免，将血浆经胃酶消化和提纯制成的被动免疫制剂，用于某些特定疾病或中毒的治疗和预防。其种类包括抗毒素和抗血清，两者间无明确界限，一般而言，前者多以细菌毒素或类毒素作为免疫原，如破伤风抗毒素，后者则多以其它类型抗原作为免疫原，如抗蛇毒血清。从我国 1951 年发布的第一部相关法规“生物药品法规草案”起至今，抗血清制品的国家标准已历经多次修订和提高[7]。2010 年版中国药典的实施，对抗血清制品的质量控制提出了新的要求。
2.4.2血清制品的制备过程的问题及解决方法
2.4.2.1工艺老化，过敏反应率高
由于抗血清为马源性制剂，对人体而言是异种蛋白，因此必然存在发生过敏反应的可能性。尽管抗血清的质量较从前已有较大提高，但过敏反应问题一直不容忽视，并已成为限制其应用的最大问题。现阶段我国的抗血清制品大多生产工艺陈旧，产品价格低廉，企业利润低，缺乏工艺改进的动力。但只有对生产工艺进行升级改进，进一步提高产品纯度和比活性，降低蛋白总量，才能从根本上降低过敏反应的风险。
2.4.2.2免疫原的质量控制过于简单
血清生产的基本原料是马血浆，马匹的免疫效果对抗血清的生产至关重要。要提高马匹的免疫效果，除优化免疫程序外，免疫原的质量也是非常关键的。然而，我国目前对免疫原的质量控制，只是在药典通则的“免疫血清生产用马匹检疫和免疫规程”中有笼统的规定，缺乏细化标准。质量标准缺乏参考依据，且一般药品企业无法自行生产，因此难以保证免疫原质量的稳定性。
2.4.2.3病毒安全性
抗血清源于动物血浆，存在病毒感染的可能性，WHO 建议，可选择适当的指示病毒和方法，对现有抗血清生产工艺的病毒灭活、去除能力进行验证[8]
2.5含活菌生物制剂
2.5.1含活菌生物制剂的质控现状
近几年来随着科学的发展，国内外对微生物的开发利用有了新的突破，除食品外，药品中的生物制剂亦有大幅度的增加，尤其是含活菌的生物制剂一拥而出，如何保证含活菌生物药品的质量是我们面临的一个重要任务。
2.5.2活菌生物药品质量标准中存在的主要问题及解决方法
目前活菌生物药品质量标准仍存在许多问题，如（1）有效菌与污染菌混杂；（2）鉴别试验以细菌共有的化学成分进行定性，没有专一性;（3）多菌株同一条件进行检验。不是科学地按加入每种菌的生物学性状进行分别鉴定，如需氧菌、厌氧菌、微氧菌在同一条件下进行分离培养、鉴定，立论不足。
以上问题说明目前含活菌生物药品的质量标准不够科学、合理，依其所做的鉴别检验，专属性不强，不能真实反映药品的质量[9]，因此，通过合理制定活菌生物药品的质量标准，应充分地了解药品中所含各种菌的生物学性状，如培养特点、形态与染色、生化反应，与本属其他菌的鉴别要点等。在此基础上，对制剂进行鉴别实验、显微检查、生化试验、含量测定、卫生学检查，制定标准时，应充分考虑加入菌的存活期，同时还要考虑贮存条件[10]。根据细菌存活期制定贮存期，否则生产的药品放置一段时间后很难达到标准规定。只有制定合理的、科学的质量标准，才能有效控制药品的质量，保障人民用药安全有效。
3对生物药品质量的展望
经过几十年的努力，我国的生物药品行业已经具备了相当的生产规模,生物药品的质量控制也逐渐向国际水平接轨。从总体上来讲，国内在生物药品质量控制标准方面基本上与国外一致,某些项目甚至比国外标准还要严格，但整个质量控制体系同时也明显存在着技术储备相对不足、检测设备型号陈旧、创新手段不多等问题。因此要使生物药品逐步接近所谓“绝对安全可靠”必须依靠科学严格的综合保证体系来实现。
3.1 国家管理部门的强制管理
国家成立专门的管理机制,制定相关法律法规和政策，对采供血事业行使极为严格的监督管理。目前我国涉及生物样品行业的法律法规主要包括：《中华人民共和国药品管理法》、现行《中华人民共和国药典》(2010年版)、《药品生产质量管理规范》、《生物制品批签发管理办法》、等，为血液制品生产的整个过程提供了法律依据和技术标准,为保证血液制品的安全提供了严格的监督和管理的标准。
3.2生产企业严格执行技术标准
现行《中华人民共和国药典》是我国监督管理药品质量的法定技术标准。血液制品生产企业必须按照GMP组织生产。GMP是药品生产质量管理规范,它对生产各环节的管理以及软硬件都提出了具体要求和规定,保证制药过程的规范性,稳定性以及保证制品安全有效具有重要意义。
3.3检测技术的创新
生物药品的质量控制涉及多种学科的理论和技术方法，包括生物化学、免疫学、分析化学、生物学、微生物学、病毒学、血液学和蛋白质学等,质量检定方法多为经典的常规方法,这已经成为新型生物药品研制快速发展的制约,建立以高技术支持的与国际接轨的生物药品质量控制体系以成为必然。随着分析技术的发展，对产品进行质量控制也趋于自动化和微型化，实时快速地对产品进行分析测定，人们已经部分实现了生物药品的自动化，并为医药、临床病理等蛋白质化学领域的研究提供了强有力的手段。但即便如此，生物药品分析仍然是充满挑战的复杂过程。
《中国药典》对于生物药品质量控制起着主导作用，但也是最低质量标准要求，由于生物药品的特殊性，其终产品的质量需要严格的原材料保证和生产过程的控制，单纯依靠终产品检验控制产品质量是不够的。因此，保证生物药品质量需要依赖严格执行GMP，按照批准的、经过验证的生产工艺和质量标准进行生产，把好原辅材料质量关等综合举措。

参考文献
[1] 毛群颖,姚 昕,梁争论,等,新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制和评价标准的研究[J],中国药事,2012,26(12):1319-1321
[2] 马庆华.Hib糖蛋白结合疫苗中残余物质质控方法研究[D].甘肃,兰州大学，2011
[3] 陈清.血液制品质量缺陷主要成因及相应对策[J].江苏医药,2010,36(22)：2724-2726.
[4] 孔 君,刘 箐,韩跃武等.单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J].免疫学杂志,2011,27,(2):170-173.
[5] Sosic Z,Houde D,Blum A．Evaluation of the iCE280 Analyzer as apotential high-throughput tool for formulation development[J].E-lectrophoresis,2008,29: 4368-4376．
[6] 孙可芳,肖 建,闭兰等.荧光标记C3D/ C4D/ CSD 单克隆抗体的质量控制[J],中国生物药品学杂志,2007,20（10）:750-752
[7] 郭中平. 人用动物免疫血清制品质量标准的回顾与探讨.中国药品标准, 2008,9 (1): 19-23
[8] 谭亚军, 张庶民. 抗血清制品的病毒去除及灭活[J]. 中国生物药品学杂志, 2009,22 (10): 1046-1048
[9] 杜平华,曹志胜.浅析含活菌生物药品的质量标准[J],中国药事,1997,11(5):337-338
[10] 中华人民共和国卫生部药品标准.抗生素生化药品注释第一册[M]. 1989: 81

（河南中医学院  冯素香）