课程43

中药中农药残留的分析和新技术的应用

1. 农药与农药残留
农药指用于防治、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成的或者来源于生物、其他天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂。
农药残留简称为农残，是指农药使用后残存于生物体、农副产品和环境中的农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。
中药是我国宝贵的文化遗产，是中华民族防治疾病、康复保健、繁衍后代的一大法宝。近年米，世界各国对天然药物的需求日益扩大，尤其对绿色药品尤为关注。现在，世界每年中药贸易额已达400亿美元，而且每年以10％的速度增长，日前我国中药出口额约6亿美元，仅占世界植物药材市场的3％～5％，这与我国中药大国的地位极不相称。中药材有效成分的不确定与农药、重金属等有害物质的残留量超标，是中药跻身世界的两大障碍。我国出口的中草药在欧美等国市场上多次因农药残留超标等原因被查扣，农药残留污染已成为中药走向世界的障碍，成为当前中药生产中急待解决的重要问题。

2. 农药的种类
农药按主要用途分类：主要有杀虫剂、杀螨剂、杀鼠剂、杀软体动物剂、杀菌剂、杀线虫剂、除草剂、植物生长调节剂等。按来源分类：主要有化学农药、微生物农药和植物性农药三大类。
化学农药是指化学合成的农药，包括有机农药和无机农药。有机农药是一类通过人工合成的对有害生物具有杀伤能力和调节其生长发育的有机化合物，如六六六。人工合成有机农药有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类。无机农药是一类包括天然矿物在内可直接用来杀伤有害生物的化合物，如硫磺等。
微生物农药是利用一些对病虫有毒、有杀伤作用的有益微生物，通过一定的方法培养，加工而成的一类农药，如白僵菌等。
植物性农药是一类以植物为原料加工制成的农药，如烟草、除虫菊等。
2.1 有机氯类农药
有机氯农药可以归纳为两大类:一类为氯代苯及其衍生物，如BHC、DDT、PCNB等。另一类为氯化甲撑萘制剂，如狄氏剂、艾氏剂等。六六六，英文缩写BHC。工业六六六是白色固体，含有多种成分和立体异构体，目前己分出7种异构体，其中含量较多的有5种，即α、β、γ、δ、ε体。滴滴涕，英文缩写DDT。滴滴涕是一种广谱有机氯类杀虫剂，其工业品为乳白色块状固体，是几种异构体与其它脂溶性杂质的混合物。滴滴涕的半衰期为2～4年，在土壤中消失95%需4～30年（平均为10年），是高度残留性的农药。
各种有机氯农药均具有挥发性低、化学性质稳定、不易分解、易溶于脂肪和有机溶剂等性质。有机氯农药属于神经毒物和实质脏器毒物，该类化合物可通过消化道、呼吸道和皮肤吸收，分布到各器官和组织，在血中几乎全部与血浆蛋白结合，主要蓄积在脂肪组织，可致癌。因其是一类高效广谱杀虫剂，我国20世纪50～7O年代曾广泛使用。
由于有机氯农药残留量大，毒性大，污染性强，造成农田严重污染。1983年我国停止了有机氯农药的生产，1984年停止使用。有机氯类农药较难降解，在环境中的残留半衰期为数年，最长可达十余年，因此在农药残留研究中仍受到重视。
2.2 有机磷类农药
有机磷农药大多数品种为磷酸酯类或硫代磷酸酯类化合物，常见有机磷农药有敌敌畏、乐果、敌百虫、甲胺磷等，其结构式如下：

中药材GAP生产中禁止使用的农药种类
                                                                                          
种类　　　　          农药名称　　　　　　　　　　　　　　               禁用原因
                                                                                          
有机氯杀虫剂          滴滴涕、六六六、林丹、艾氏剂、狄氏剂 　　          高残毒
有机砷杀虫剂          甲基砷酸锌（稻脚青）、甲基砷酸钙砷（稻高残毒宁）   高残毒
                         甲基砷酸铁铵（田安）、福美甲砷、福美砷
有机汞杀虫剂 　       氯化乙基汞（西力生）、醋酸苯汞（赛力散）           剧毒、高残毒
卤代烷类熏蒸 　       二溴乙烷、环氧乙烷、二溴氯丙烷、溴甲烷             致癌、致畸、
阿维菌素　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　                高毒
无机砷杀虫剂 　       砷酸钙、砷酸铅　　　　　　　　　　　　　           高毒
有机磷杀虫剂 　       甲拦磷、乙拦磷、久效磷、对硫磷、甲基对硫磷、       剧毒、高毒
                      甲胺磷、异柳磷、治螟磷、氧化乐果、磷胺、
                      地虫硫磷、灭克磷（益收宝）、水胺硫磷、氯唑磷、
                      硫线磷、杀扑磷、特丁硫磷、克线丹、苯线磷、
                      甲基硫环磷
氨基甲酸酯            涕灭威、克百威、灭多威、丁硫克百威                 高毒、剧毒或
杀虫剂　　　 　       丙硫克百威　　　　　　　　　　　　　　　           代谢物高毒
二甲基甲脒类 　       杀虫脒　　　　　　　　　　　　　　　  　           慢性毒性、致癌
氟制剂　　　  　      氟化钙、氟化钠、氟乙酸钠、氟铝酸胺、 　            剧毒、高毒、
　　　　　　 　       氟硅酸钠　　　　　　　　　　　　　　 　            易产生药害
有机氯杀螨剂  　      三氯杀螨醇　　　　　　　　　　　　　　             含滴滴涕
有机磷杀菌剂 　       稻瘟净、导师稻瘟净、（异嗅米）　　　　 　          高毒
                                                                                        

3. 中药的农药污染途径
中药的农药污染途径有：直接污染、间接污染、加工流通中的污染和食物链造成的污染。
3.1 直接污染
中药材在种植过程中滥用农药，使得大量药剂直接附着在植株上。由于中药材的种植者缺乏基本的植保常识，未重视农药残留问题，滥用农药的现象十分严重。有些药材的种植者对农药的选择标准是高效、便宜，很少顾及农药毒性及高残效对中药材质量的影响。为保产增收，种植者施药次数频繁，且经常是几种高毒农药混配使用，特别是在虫害严重时期，使用农药的浓度加倍，不仅杀死了大量病虫害的天敌，而且使得病虫抗药性增加、防治成本和防治难度越来越大，同时造成了中药材农药残留超标，加重了农药在药材产区周边环境中的残留，给药材生产带来了持续性的危害，形成了难以逆转的恶性循环，使药材质量越来越差。
3.2 间接污染
中药材从环境中被动吸收一些高残留农药。在中药材种植和生产过程中，忽视种植环境对药材的污染，如：药材生长周围环境土壤、水源、大气的污染等。虽然高残留的有机氯农药六六六、滴滴涕早在70年代就被禁用，但这些农药半衰期长达60年，容易通过食物链在植物体内形成生物累积。其他农药如有机磷、氨基甲酸酯、菊酯类杀虫剂的化学结构中多有不稳定的酯键，残效期一般都比较短，因此这几类农药在中药材中检出的残留量低或残留情况较少。
3.3 加工流通中的污染
在中药材采收、加工、保存、运输过程中造成的农药污染也十分严重，如一些中药材产区，在施用农药后不久就开始采收；药材炮制过程中加入的辅料中含有较高的农药残留；使用包装、运输过农药的媒介物来包装、运输中药材等。
3.4 食物链造成的污染
由于环境和食物链被污染和破坏，动物类中药材可以因食物链的蓄积而被污染，就可能威胁人类健康。
4. 中药农药残留的监控现状
国际上从1970年起开始研究药用植物的农药残留问题，1980年世界卫生组织将农药残留测定单独列为检测项目。自20世纪80年代初期开始，我国中成药工业就开始推行药品GMP（Good Manufacture Practice）制度，但由于各种原因，作为中成药生产原料的中药材生产质量管理规范（GAP）认证工作进展较为缓慢。我国目前现有的各项标准参差不齐，有国家药典标准、部颁标准和地方标准。GAP的制定和实施严重滞后，制约了中成药产品质量的提高，更加严重地阻碍了我国中药产品的国际竞争力。
中国药典2000版一部首次对黄芪和甘草制定了限量标准（总BHC不超过千万分之二，总DDT不超过千万分之二，PCNB不超过千万分之一），附录也首次收载了有机氯农药测定，标志着我国对于药材农药残留的研究已进一步规范化，标准化，法制化。2001年7月1日起实施国家对外贸易经济合作部发布的“药用植物及制剂进出口绿色行业标准”，规定的限量指标总BHC、总DDT和PCNB含量均不得大于0.1mg•kg-1。关于总BHC、总DDT的标准，“进出口绿色行业标准”高于中国药典2000年版的规定。
2002年我国颁布“中药材生产质量管理规范（GAP）（试行）”，自2002年6月1日起实行。为我国中药材的生产和质量管理提供了相应的理论依据和法律规则。
《中国药典》2005年版开始对国内中药产品的无公害标准作出强制性规定，此次规定的核心内容是中药产品中的重金属及砷盐、黄曲霉素、农药残留及微生物含量必须不超标。这一强制规定使更多的中药材种植和生产企业向国际市场迈进，以提高我国中药材出口水平。
5. 中药农药残留的检测方法
我国当前的中药材中农药残留分析方法研究以气相或液相色谱配备不同的检测器为主，较少采用各种色质联用技术；大部分采用传统的提取、分离手段，被测农药主要集中于有机氯类农药，其中以六六六、滴滴涕为主，研究仍集中在个别中药材品种或某类农药的检测方法研究，尚没有中药材中农药残留全分析的研究报道。
随着人们对食品、环境安全的日益关注以及新的、更高要求的农药残留限量标准的出台，农药残留分析技术发展迅速。现代农药残留分析技术通常包括样品前处理和测定两部分。
5.1 前处理技术
农药残留分析前处理是指将残留农药从样品中最大限度地提取出来，并消除分析检测过程中的干扰物，主要包括样品制备、提取、净化、浓缩等步骤。
前处理技术主要液-液萃取、液-固萃取、索氏提取、超声波提取、微波辅助萃取和加压液体萃取等。
液-液萃取：优点是萃取分离法设备简单；其不足之处是选择性差，常有大量共提物，需进一步分离净化，溶剂消耗量较大且具有毒性。液-液萃取提取剂的选择：①农药残留量测定属痕量分析，因此对溶剂纯度要求较高，应尽量选用农药残留级或者环境保护分析专用试剂。②采用相似相溶原理来选择溶剂，极性小的农药应选择低极性溶剂提取，如六六六、DDT等应选用石油醚、正己烷等。③沸点一般要求在45～80℃之间，沸点过低，易挥发，不易操作;沸点过高，则不易浓缩，并会引起不稳定农药的分解。
固相萃取技术（SPE）：利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再利用洗脱液洗脱或加热解吸附。用于液相色谱分析农药残留量的样品前处理，目的是分离和富集目标化合物。分离模式根据填料的不同，SPE主要有正相SPE、反相SPE和离子交换SPE等类型。优点是克服了液液萃取乳化技术，只需5～1Omin。溶剂量为液-液萃取法的10%，减轻了有机溶剂对人身和环境的影响。固相萃取技术（SPE）操作步骤为：进样前活化处理，上样，洗涤，洗脱。
5.2 检测技术
农药残留检测技术主要有薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、毛细管电泳法、酶抑制法、免疫分析法等。
气相色谱法（GC）：在已报道的文献中，对残留农药的检测大部分采用GC法。本法适用于易气化且气化后不发生分解的农药，气相色谱柱以毛细管柱为主。常用的检测器：分析有机氯类和拟除虫菊酯类农药采用电子捕获检测器（ECD）、分析有机磷农药采用火焰光度检测器（FPD）、分析含氮的农药和氨基甲酸酯类农药采用氮磷检测器（NPD）等。优点是分离效果好，选择性强，灵敏度高。
免疫分析法：是基于抗原、抗体特异性识别和结合反应为基础的分析方法。90年代优先研究开发利用的农药残留分析技术，联合国粮农组织（FAO）已向许多国家推荐此项技术，美国化学会将免疫分析与气相色谱、液相色谱共同列为农药残留分析的支柱技术。由于免疫分析固有的优点，它在农药残留及其它环境污染物如多联苯、二噁英、天然真菌毒素、抗菌素、添加剂等快速筛选和定量检测方面发挥着重要作用。免疫分析法分为放射免疫分析（RIA），酶免疫法（EIA），荧光免疫分析（FIA），免疫传感器，免疫亲和色谱法（IAC），流动注射免疫法（FIIA）等方法。
酶联免疫吸附法（ELISA）：通过在合适的载体上，酶标记的定量抗原与未知抗原竞争固相抗体结合位点或固相抗原与未知抗原竞争酶标记定量抗体的结合位点，形成复合物;在底物参与下，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成带色物质，依靠比色法来确定农药残留量。ELISA法优点是特异性强，无需复杂的检测设备，快速简便，在食品农药残留的检测中应用较多，检测水平可达ng或pg水平。缺点为出现假阴性或假阳性结果;且农药不具有免疫原性，必须与载体蛋白质连接形成农药-载体蛋白质结合物免疫原，才可用来制备抗体。
生物传感器法：通常是指由一种生物敏感部件与转换器紧密配合，对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆性响应的分析方法。传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的分析物之间(如酶和底物、抗体和抗原、外源凝聚素和核糖核酸与其互补片段间)的识别反应会产生一些物理化学信号（如光、热、声、质量、颜色、电化学等）的变化，这种变化通过不同原理的转换器（如光电倍增管、压电器、光极、热敏电阻、离子选择性电极等）转换成第二信号（通常为电信号），经放大后显示或记录。生物传感器按照生物功能区分为酶传感器、组织传感器、微生物传感器等。第三代生物传感器的主要特征：将生物技术与微电子技术相结合。利用农药对靶标酶（如乙酰胆碱酯酶）活性的抑制作用研究酶传感器，利用农药与特异性抗体相结合的反应特性研制免疫传感器，可用于对相应农药残留物进行快速定性定量检测。微型化、响应速度快的生物传感器所需样品量极少，甚至可插入生物组织或细胞内实现超微量在线快速跟踪分析。主要问题是分析结果的稳定性和重现性较差，使用寿命较短。
发达国家经常采用先进的农药残留检测技术加强农药残留监测工作，所用检测技术如气相色谱与质谱联用技术、液相色谱与质谱联用技术、毛细管电泳与质谱联用以及气相、液相色谱与多级质谱联用技术等，这些技术的应用大大提高了农药残留检测的定性能力和检测的灵敏度和检测覆盖范围。目前国外已发展和建立了可同时检测几百种农药的多残留分析系统，美国的FDA的多残留检测方法可检测360多种农药、德国DFG方法可检测325种农药、荷兰卫生部多残留检测方法可检测200种农药、加拿大多残留检测方法可检测251种农药（其中GC-MS检测239种，HPLC-Fluor检测12种）。随着高新分析技术引入农药残留检测之中，农药全分析技术的应用大大提高了检测的效率和系统性，使得经常性的农药残留全面监测成为可能。
6. 展望
有关农药残留的检测方法将进一步向多残留快速测定方向发展，在检测方法与国际双向接轨的基础上，将开展大面积的中药中有害残留物普查，建立基础数据库，提出合理的限量标准，建立科学的风险评估和应急体系，保障人民用药安全的同时打破国际技术壁垒。另一方面，大力推进GAP建设和环境改造，从根本上保证中药质量。
积极开展对国际标准的研究工作，参与国际农药残留的制定。加紧中药农残的检测技术研究，改善设备，重视国外先进检测方法。加强GAP对中药材生产实施规范化管理，最大限度地保证药材内在质量的可行性、稳定性，以达到“安全，有效产量稳定、可控”的目的。采取有效措施，减少采收、加工、包装及贮存过程中的污染。
我国既是中药材生产大国，也是中医药的最大消费市场。随着世界经济一体化发展进程的加快，我国的中药材及中成药必然要走向国际市场参与竞争。药品质量是影响我国中药出口的首要因素，而农药残留污染则是影响药品质量的重要因素。只有严把中药及制剂的质量关，才能使中药真正达到治病救人的目的，才能使中医药事业更加健康地向前发展，才能促进中药现代化和国际化，相信我国中药生产必将进入有序良性发展轨道。

（河南大学  程铁峰）